La sala presenta opere databili tra la fine del XIV e l’inizio del XVI secolo. Non è noto se appartenga all’antico arredo di una cappella della cattedrale la frammentaria e disastrata pala raffigurante la Madonna con Bambino in trono tra i Santi Giacomo e Andrea, attribuita a Girolamo di Benvenuto (Siena 1470-1524) e datata agli inizi del ‘500. Di un certo interesse è anche una grande scultura lignea policroma, il Crocifisso, ora visibile soltanto come Cristo in Pietà, di probabile manifattura toscana del Tre-Quattrocento, proveniente dalla Chiesa parrocchiale di Macciano.
Il primo Cinquecento è rappresentato dalla tavola della Madonna col Bambino tra Santa Mustiola e San Felice, proveniente forse dalla Basilica di Santa Mustiola, come farebbe supporre la presenza dei due santi. L’opera è stata riferita al pittore senese Marco Bigio (Giomo del Sodoma?), attivo nella prima metà del XVI secolo.
Tra gli arredi sacri provenienti dal territorio diocesano meritano una attenzione particolare alcuni importanti pezzi di oreficeria: la croce di altare di Celle sul Rigo e le due croci provenienti da Cetona. La prima, già nella pieve di San Paolo Converso, costituita da lamine sbalzate e incise in rame dorato, è riferibile ad un orafo senese attivo tra l’ultimo quarto del Trecento e i primi anni del Quattrocento, molto attento ai risultati raggiunti da Domenico di Niccolò nella scultura e da Giovanni Turino nell’oreficeria, con soluzioni formali ancora di gusto gotico. Alla stesso ambito cronologico fanno riferimento anche una delle due croci cetonesi e un esemplare da Trequanda, mentre dalla Collegiata della Santissima Trinità a Cetona proviene la rara e preziosa croce reliquiario (stauroteca) in rame dorato, datata 1436, arricchita da pietre dure e da miniature su pergamena seicentesche sul verso, di certo riconducibile ad una bottega orafa senese, forse da riferire addirittura a Goro di Ser Neroccio (Siena 1387-post 1456).